智连星医

撰稿 | 俞心语

责编 | 刘坚袁增壮

2022年9月2日，剑桥大学英国剑桥癌症研究所的研究员在Nature Genetics上发表发表了题为"The NALCN channel regulates metastasis and nonmalignant cell dissemination"的研究论文。此项研究中，研究员确定了NALCN(钠泄漏通道非选择性蛋白）作为上皮细胞运输到远处组织的关键调控因子。他们发现NALCN调节恶性上皮细胞和正常上皮细胞进入血液，使这两类细胞被运输到身体其他部位，分别形成转移性癌症和明显正常的组织。同时，这项研究也证明了转移级联反应可以独立于癌症而发生。

大多数癌症患者死于癌症转移，阻断转移可以显著提高癌症患者生存率，但是癌症转移如何被触发目前还不清楚；一直以来人们都致力于通过识别突变基因来寻找癌症转移的驱动因素，但迄今为止没有鉴定出任何导致复发转移的特定突变。这项研究发现单一蛋白NALCN可以调控癌症转移，为临床医学抑制癌转移提供了新的思路。

该研究的内容可以从以下五方面来阐述。

1. 在癌细胞中，发现NALCN表达下调或丧失功能

在之前的研究中，他们证明了在胃部PROM1蛋白特异地在胃窦腺的基底干细胞中被表达，且构建了Prom1^CreERT2/LacZ;Kras^G12D;Trp53^Flx/Flx可以形成腺癌的P1^KP品系小鼠（注：突变了抑癌基因Kras ；在PROM1表达的细胞中，CreERT2在taximofen诱导下表达Cre，敲除P53）。

他们发现P1^KP小鼠形成的胃腺癌细胞（P1^KP-GAC）中表达PROM1，说明P1^KP-GAC来自于胃窦腺基底干细胞。为研究基底干细胞的转化，他们比对了P1^KP-GAC和基底干细胞的转录组，发现在P1^KP-GAC中选择性下调了一些离子通道和转运蛋白，其中NALCN（负责维持膜静息电位和细胞兴奋性）被下调。且在人类癌症基因图谱中，NALCN的非同义突变在多种癌症中富集(见图A），表明NALCN可能是抑癌因子。

为了确定非同义突变如何影响NALCN在癌症中的功能，研究者们进一步构建了NALCN离子通道的模型，预测导致通道最大孔隙闭合的突变在晚期癌症富集（见图B）。此外，NALCN突变的人类GACs上调了与上皮细胞向间充质转化（EMT）、转移和细胞迁移相关的基因。

接下来，研究员测试了NALCN能否调控癌症进程。他们通过向P1^KP-GAC细胞施加shRNA来抑制NALCN的表达，通过含有Nalcn-cDNA的慢病毒转导来上调NALCN的表达。发现消除NALCN电流后（即关闭NALCN蛋白，切断离子流），GAC增加了细胞增殖，被赋予了EMT的形态和转录组的特征；上调NALCN表达后，GAC减缓了细胞增殖，获得了超上皮化的形态特征。

（图一：在癌细胞中，NALCN表达下调）

2. 失去Nalcn促进癌细胞转移

研究员将Nalcn^FLX/FLX品系的小鼠与P1^KP、Villin1^CreERT2;Kras^G12D;Trp53^Flx/Flx (V1^KP)、Pdx1^CreERT2;Kras^G12D;Trp53^Flx/+(Pdx1^KP)的小鼠品系杂交（注：Villin在肠中表达，所以杂交一代肠细胞为NALCN^FLX/+;Pdx1在胰腺中表达，同理）。最终产生产生Nalcn基因型为+/+、+/-、-/-的相同数量的雄性和雌性小鼠。并且这些小鼠都带有谱系追踪基因Rosa26^ZSG（非编码Rosa基因内都插入了一段LOXP-STOP-LOXP-GFP）。Prom1^CreERT2/LacZ通过在多种干细胞和祖细胞中表达，诱导了P1^KP小鼠产生多处原发癌；V1^KP和Pdx1^KP分别被诱导产生了肠道和胰腺癌。对肿瘤进行详细的宏观分析和显微镜分析显示，诱导年龄、性别和有无NALCN对肿瘤发生率、类型、生存期、肿瘤生长率、免疫细胞浸润、增殖或其他关键的原发肿瘤特征无显著影响（见图C）。

Nalcn的缺失显著增加了P1^KP、V1^KP和Pdx1^KP小鼠的癌症转移（见图D）。基因型为Nalcn^+/+的V1^KP-IACs,Pdx1^KP-PACs平均每只小鼠分别观察到2.82±4.88个转移肿瘤和 5.53±4.02个转移肿瘤；而在 V1^KPNalcn^+/Flx和V1^KPNalcn^Flx/Flx的小鼠中分别观察到了 16.82±5.69个和 26.04±10.18个转移肿瘤，在Pdx1^KPNalcn^+/Flx和Pdx1^KPNalcn^Flx/Flx分别观察到15.04±3.62个和13.46±5.01个转移肿瘤。进一步，实验者用GdCl₃（NALCN抑制剂）处理了V1^KPNalcn^+/+小鼠，对照组的每只小鼠转移肿瘤数为2.82±4.88个而实验组转移肿瘤数高达18.32±5.95个。

注：P3是第三天加taximofen诱导Cre，P60是第六十天加taximofen诱导Cre

（图二：NALCN的缺失显著增加小鼠的癌转移）

3. NALCN调节循环肿瘤细胞（CTC）数

由于Nalcn缺失增加了肿瘤转移且在GACs、IACs（肠腺癌细胞）和PACs（胰腺癌细胞）中表达的基因在人CTC转录组中富集表达，研究者们推测Nalcn可能调节原发肿瘤中CTC的释放。在施加taximofen后，谱系追踪基因Rosa26^ZSG的绿色荧光蛋白表达，外周血的转移癌细胞可以使用FACS识别。实验证明，Nalcn缺失或施加GdCl3显著增加了长有肿瘤的P1^KP、V1^KP和Pdx1^KP小鼠的CZCs（circulating ZSG+ cell）水平（见图E）。

为更好了解CZCs的起源，研究员们将小鼠P1^KP-GAC起源的CZCs、外周血单个核细胞（PBMCs）与人类CTCs和PBMCs的scRNA-seq结果相比较，发现小鼠CZC和人类CTC转录组存在显著重叠（见图F）。

研究员们进一步直接检测了CZCs是否具有转移癌细胞的潜能。他们从带有P1^KP-PAC, P1^KP-GAC 或者V1^KP-IAC的小鼠中分离出25,000个CZCs，注射到免疫缺陷小鼠中，75天内所有小鼠在肺、肝、肾和/或腹膜内发现了大量的ZSG+癌细胞的转移（后续研究发现10个CZCs就足够）（见图G、H）。

综上，CTCs中大量富集了与人类CTC转录组显著重叠的CZCs，并是通过Nalcn调控释放进入外周血的。

（图三：NALCN缺失上调CTCs数量）

4. NALCN调控循环中的非肿瘤细胞

肿瘤转移是复杂的级联反应，防止CTC脱落到外周血以阻止转移十分具有挑战性。后续实验研究员从非肿瘤细胞入手。他们发现从未长癌的Prom1^CreERT2/LacZ；NALCN^FLX/FLX小鼠中分离出的胃干细胞迅速上调侵袭相关基因和EMT相关基因，暗示NALCN调节未发生转化的细胞从实体组织脱落。为了检验，他们统计了Prom1^CreERT2/LacZ;Rosa26^ZSG;Nalcn^+/+ (P1^RNalcn⁺^/+）、P1^RNalcn^+/Flx、 P1^RNalcn^Flx/Flx等从未长过肿瘤的小鼠中外周血的ntCZCs，发现Nalcn的缺失增加了这些小鼠的CZCs的数量（见图I），达到了与在长有肿瘤小鼠中tCZCs数量相似的水平。scRNA-seq 测试结果显示ntCZCs、tCZCs图谱与转移的癌细胞共聚而不与原发性肿瘤共聚，且ntCZCs与tCZCs表达谱与人类CTCs相匹配(见图J)。

实验员将分离出的25000个ntCZCs注射入免疫缺陷小鼠的尾静脉，所有小鼠100天后临床表现良好，但在其肺、肝、肾和腹膜内含有大量的ZSG+供体细胞簇，其频率与尾静脉注射tCZCs形成的转移性肿瘤相似。而且被转运的ntCZCs在靶器官中形成了明显正常的结构，最极端的例子是肾小球和肾小管（见图K:转移CZCs在肾中形成肾小球和肾小管，见图L:激光扫描共聚焦显微镜下，P1^R Nalcn^Flx/Flx 小鼠肾中CZCs形成的组织）。

综上，NALCN调节独立于癌症的实体组织的细胞脱落，这一过程与肿瘤无关，揭示一个致癌基因无关的转移途径。

（图四：NALCN缺失导致非肿瘤细胞转移）

5. NALCN阻断可导致系统性纤维化

尽管P1^RNalcn^+/Flx和P1^RNalcn^Flx/Flx小鼠没有发生癌症，但这些小鼠的全身尸检显示与P1^RNalcn^+/+小鼠相比有严重的肾脏和皮肤纤维化。研究数据强烈表明，钆阻断NALCN通道可以动员各种上皮组织中的上皮细胞，并将上皮细胞运输到肾脏和其他器官，最终引起纤维化反应。

简评

癌症患者多数死于癌细胞扩散。这项研究从复杂的癌转移过程中发现了单一的可以调控癌转移的蛋白NALCN。通过促进原位癌的NALCN表达来抑制癌转移，可以为临床医学攻克癌症提供新的方向。同时通过调节NALCN的表达可以实现正常组织细胞的迁移并在靶细胞形成新的组织，未来可研究能否通过这种迁移实现器官修复。NALCN通道调节癌症转移和非恶性细胞转移的分子机理或许值得进一步深入探究。

---Yu Xinyu

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41588-022-01182-0

参考文献：

1.Dillekås, H., Rogers, M. S. & Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases? Cancer Med. 8, 5574–5576 (2019).

2.Ganesh, K. & Massagué, J. Targeting metastatic cancer. Nat. Med. 27, 34–44 (2021).

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