撰稿 | 袁增壮
责编 | 刘坚
2022年1月，美国加州大学旧金山分校的Matthew F. Krummel教授及其团队在Cell上发表题为“Discovering dominant tumor immune archetypes in a pan-cancer census”的研究文章，该研究利用来自300多名患者的机体肿瘤，通过流式细胞术的聚类计算和源于细胞亚群的转录组学数据，描述了可用于癌症肿瘤分类的12种“免疫原型(immune archetypes)”，从而揭示了跨癌症的免疫成分特征的主要模式，为了解肿瘤免疫以及确定广泛的治疗靶点提供了一个框架。
癌症免疫疗法能利用机体的免疫系统来抵御癌症，自被开发用作治疗多种类型癌症的生物学疗法以来一直拥有巨大前景，但仍存在许多患者采用免疫疗法后临床获益极少甚至没有，更深入地了解人类恶性肿瘤免疫微环境的多样性对于改进免疫治疗策略至关重要。目前已有研究借助单细胞RNA测序(scRNA-seq)定义单一癌症的肿瘤微环境(TME)多样性或单个免疫细胞亚群，但对肿瘤免疫微环境中高分辨率和跨多种癌症类型的“共有特征”的识别仍然缺乏。
为了研究不同癌症TME中的主要免疫成分，该团队利用细胞流式技术对肿瘤样本(膀胱癌(BLAD, n=15)、结直肠癌(CRC, n=30)、胶质母细胞瘤(GBM, n=1)、妇科肿瘤(GYN, n=47)、肝癌(HEP, n=7)、头颈癌(HNSC, n=24)、肾癌(KID, n=53)、肺癌(LUNG, n=35)、黑色素瘤(MEL, n=31)、胰腺导管腺癌(PDAC, n=1)、原始神经外胚层肿瘤(PNET, n=6)、肉瘤(SRC, n=10))的单细胞悬液进行了免疫表型鉴定，同时基于bulk RNA-seq进行了细胞分类以确定6个广泛定义的细胞群体中的基因表达模式，接着重点研究了TME中3种主要细胞类型(T细胞、髓系细胞和基质细胞)的丰度，结果同先前研究一致，证明了来源不同的肿瘤之间与肿瘤内部存在巨大异质性，进一步说明有必要对肿瘤进行超越起源组织的分类。随后作者利用其队列中与细胞流式和RNA-seq数据相关的显著特征，为T细胞、髓系细胞和基质细胞定义了独特的基因特征，通过分析基于该特征的丰度评分，研究者发现当验证队列中来自live RNA-seq数据时，该分数与流式获得的细胞类型比例显示出高度一致性，与起源组织无关，此外，根据基因评分对来自不同组织的肿瘤进行排序，结果发现与流式检测具有相似趋势和明显相关性(图一)。
图一：泛癌主要免疫成分的高维研究
接着该团队使用算法对样本的3个特征(T细胞、髓系细胞和基质细胞)进行了无监督聚类并用UMAP在IPI与TCGA数据集中将其可视化，通过最小化Davies-Bouldin index(DBI)来评估最佳聚类参数，在IPI(Immunoprofiler Initiative)数据队列中分离出两个免疫富集簇(IR、IS(R))和两个免疫匮乏簇(ID、ISD)，最终确定了仅存在一种免疫特征富集的集群，即T细胞为中心(TC)和以髓系为中心(MC)。将基因评分应用于TCGA队列也会在最小化DBI时产生对应于IPI队列中发现的聚类。为了验证细胞流式的数据，研究者对收集的组织进行了免疫荧光分析，观察到来自IR簇的样本具有最高的CD45+浸润率，而ID样本则相反。借助免疫荧光法评估，发现髓系中心(MC)簇群与ID簇群在CD45+总的浸润方面相似，而用细胞流式检测时发现，MC簇群显示出中等的CD45+细胞比例，组织分离后所有细胞之间的免疫细胞比例与活细胞之间的免疫细胞比例之间存在显著的相关性。考虑到趋化因子在免疫细胞募集中的重要性，作者试图确定这些“免疫原型”-免疫特征集群-是否具有独特的趋化因子基因表达特征，于是基于39种趋化因子推导出特征评分，并发现在IPI和TCGA队列中IR簇得分较高，ID簇得分较低，进一步验证分析表明，肿瘤组织的特征评分确定了6个独特的簇，这些簇由不同程度的免疫浸润和不同趋化因子组的表达定义(图二)。
图二：基于两个独立数据集的聚类算法识别实体瘤粗略免疫原型
为进一步验证这些原型，研究者利用TCGA队列中的大量临床数据集，试图广泛评估这些简单的原型分类是否与预后相关，结果发现IR原型的5年总生存率明显优于所有其他类型，且总体趋势与总体免疫浸润有关。随后作者分析了IPI和TCGA中原型的分布，研究者发现虽然两个队列中原型的相对组成大致相似，但仍存在一些差异，同时某些肿瘤类型的原型分类似乎对生存结果进行了分层，而其他个别肿瘤类型的趋势较弱。基于上述结果作者考虑，这些粗略的免疫原型可能无法捕获肿瘤中免疫细胞的全部异质性，这一假设也经流式检测得到验证(图三)。
图三：粗略免疫原型与总存活率而非组织来源有关
针对上述问题，作者利用流式数据，对肿瘤类型之间以及肿瘤内部的差异，按肿瘤类型对肿瘤进行分组，以评估活细胞中调节性T细胞(Treg)的变化以及T细胞中CD4+/CD8+T细胞的比例。通过重复先前的分析方法后优化产生了8个簇，形成的两个新簇由CD4与CD8比值描述，对趋化因子基因表达的评估表明，这种重新聚类显著分离了IR原型中的趋化因子基因表达，并进一步细化了在其他原型中发现的趋化因子表达(图四)。
图四：以CD4/CD8比值细分免疫原型
基于细化后的免疫原型，该团队还评估了T细胞耗竭和肿瘤中髓系的异质性，根据分析结果又添加了4个单核吞噬细胞(MNP)子集特征，包括巨噬细胞、单核细胞和两种典型树突状细胞，然后重复无监督聚类。DBI最小化后，聚类产生了12个独特的肿瘤免疫原型，正如先前添加T细胞亚群时所观察到的那样，添加四个MNP测量值细分了先前存在的免疫原型，但不会像随机分类那样将这些原型加倍。具体而言，单核细胞/巨噬细胞比值划分了两种不同的IR CD8偏向原型，其中富含巨噬细胞的肿瘤标本中Treg丰度通常较高，单核细胞/巨噬细胞与T细胞亚群组成之间的关系在12个原型中也存在显著差异。通过分析作者发现，不同原型中巨噬细胞和其他免疫细胞丰度之间的存在不一致性，暗示广义的巨噬细胞评分不能反映巨噬细胞表型的关键异质性，或者巨噬细胞和T细胞可能存在尚不明确的数量调节关系(图五)。
图五：基于scRNA-seq的髓系特征细化免疫原型
此外，作者还研究了与细胞丰度和未用于聚类的基因集之间的关联。根据已有研究并结合验证发现，免疫原型特异性的免疫成分模式与趋化因子转录物组的特异性富集相关。值得注意的是，对趋化因子受体家族具有特异性的趋化因子在新细化的免疫原型中共同聚集。接着作者使用髓系RNA-seq来探索先前与肿瘤浸润性MNP相关的基因表达水平，结果发现原型中与M1和M2巨噬细胞表型相关的单个基因表达存在异质性，但IS原型中M2基因普遍富集。另一方面，DC和共刺激物相关基因在以T细胞为中心的富含DC的原型中高度表达，但LAMP3、FCSN1和CCR7表达在原型中并不一致，这表明原型之间的树突状细胞转录组状态可能存在异质性，为进一步阐明在髓系中发现的异质性，该团队将髓系"特征” 基因集与其他12个与Treg、Tconv、B细胞、浆细胞和NK细胞亚群高度相关的基因集结合起来，并根据这些基因集在原型中的中值表达对其进行了分层聚类，最终发现每个原型都有不同的免疫特征(图六)。
图六：每种肿瘤原型均由独特组合的免疫基因表达模式定义
最后，作者试图研究原型与肿瘤细胞自身表型间的关系。如最初的粗略原型所示，细化后的原型在其起源组织上是多样的，但一些肿瘤类型在原型中仍然具有高度代表性。尽管存在常见的癌内异质性，该团队依旧观察到肿瘤增殖能力与ID和髓系中心原型之间存在密切关系，于是作者收集了肿瘤生物学各个方面的基因特征，以确定免疫特征是否能够映射到肿瘤生物学。细胞周期相关基因的表达表明ID原型中的肿瘤细胞增殖能力增强，与Ki67数据结果相同，然而IR和IS肿瘤在其他转录组学程序中富集，如干扰素刺激基因(ISG)、衰老或上皮-间充质转化(EMT)相关基因，只有部分ID原型在纤维化相关基因中高度富集。通过进一步分析研究，该团队为12个原型分别确定了独特的基因特征，同时还发现当使用多变量生存回归对肿瘤进行生存分析时，发现无论起源组织如何，具有相似T细胞亚群富集的原型之间存在显著的结果差异，这表明该肿瘤原型为研究多种原发性人类癌症中不同亚型的抗肿瘤免疫反应提供了模板(图七)。
图七：免疫原型与肿瘤生物学和疾病进展密切相关
简评
本研究中作者利用一个由涵盖12种肿瘤类型的364个患者标本的独特数据集，研究并确定了保守的肿瘤免疫原型。使用基于肿瘤特异性免疫基因特征的无监督聚类方法，以细胞流式检测的"基本事实”细胞类型组成数据为基准，识别和验证了TCGA数据集中也能鉴定出这12种独特的肿瘤免疫原型，尽管不同肿瘤样本数量有限，该团队通过多种人类实体瘤类型的TME的综合表征揭示了由不同细胞网络定义的共同的、可重复的免疫原型的存在，这些数据依旧为研究癌症免疫和癌症靶点以提高免疫治疗反应提供了前所未有的资源。
——袁增壮
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867421014264?via%3Dihub
