2022年3月31日，美国西奈山伊坎医学院的Brian D. Brown团队在Cell上在线发表题为”Spatial CRISPR genomics identifies regulators of the tumor microenvironment”的文章。该文章开发了一种名为“扰动图谱（perturb-map）”的空间功能基因组学的方法，结合CRISPR库、多重成像和空间转录组学，以识别肿瘤组成、组织和免疫的遗传决定因素，从而在保留了空间结构的同时，以单细胞分辨率为组织内的功能基因组学建立了Perturb-map，并为癌细胞TGFβ反应如何影响TME提出了见解。图片

研究背景

肿瘤的细胞组成，空间结构和组织定位对癌症的进展和对治疗的反应有重大影响。这些因素与肿瘤免疫特别相关，因为免疫细胞组成和肿瘤微环境（TME）内的定位是对免疫治疗和患者结局反应的主要决定因素之一。空间分辨的单细胞和区域测序表明，许多遗传上不同的亚克隆存在于肿瘤附近，并且可以具有不同的TME组成；然而，特定基因如何影响TME，或者邻近的克隆如何相互影响尚不清楚。事实上，虽然已经确定了一些参与协调TME的基因，但许多基因在影响肿瘤的结构和免疫组成方面的潜在作用尚未确定。TME组成复杂；由许多不同的免疫和非免疫细胞类型组成，其比例，位置和运动都是相互影响的因素 。许多基因功能取决于组织的背景以及与特定细胞类型和结构的空间接近度。

研究流程

研究人员建立了一种体内空间组学的方法——Perturb map。Perturb-map 基于蛋白质条形码（Pro-code）系统，该系统利用少量线性表位(抗原表位中，连续线性排列的氨基酸组成的特定表位)的三重态组合来创建一组更高阶的唯一条形码，可以标记表达不同CRISPR gRNA的细胞。

随后，研究人员建立了一个核Pro-code (nPC) /CRISPR 慢病毒（LV）载体库，靶向35个编码细胞因子信号通路调节因子（包括IFNα，IFNγ，TGFβ和TNFα的受体）以及参与免疫细胞相互作用的配体和分泌因子的基因（例如，B2m，Cd47，Cd274和Cxcl17）的调节因子，作为对照，研究人员靶向了F8基因，该基因不由KrasG12D以及p53缺失的KP肺癌细胞表达。之后，研究人员使用Pro-Code鉴定来确定每个肿瘤中表达的CRISPR。从注射nPC/CRISPR KP细胞的11只小鼠中，鉴定出1750个不同的表达Pro-Code的肿瘤。为了确定是否有任何靶向基因影响体内肿瘤发展，研究人员将携带特定nPC/CRISPR（已经敲除基因并造成相应的nPC增多）的肿瘤比例与预注射细胞混合物中相同nPC/CRISPR（还未产生影响）的相对频率（由CyTOF（质谱流式细胞术，一种基于荧光流式细胞术的改变）确定）（图1F）进行比较。研究人员发现对照组F8以及其他几个靶向基因的相对比例没有变化，但许多nPC / CRISPR的频率发生了重大变化，表示了相关基因影响肿瘤生长。另外，Perturb-map还能够评估不同的基因如何影响肿瘤结构，在它的帮助下，研究人员发现Socs1和Tgfbr2的基因扰动导致KP肺肿瘤病变的显着不同。Socs1的丢失与胸膜斑块和鳞状肿瘤的发展有关，这是两种分化不良的肿瘤病变类型。Tgfbr2的丢失导致基质重塑并诱导高度纤维粘液性肿瘤的发展（图1H，图1I，图2B，图2D）。这与肿瘤大小或病变数量无关，因为Socs1和Tgfbr2靶向病变在这方面相似，但具有非常明显的组织学状态。这些研究表明，Tgfbr2和Socs1的缺失以截然不同的方式改变了KP肺肿瘤的结构。图片

（图1：perturb-map确定了体内调节肿瘤发展和结构的基因）

（图2：perturb-map确定了体内调节肿瘤发展和结构的基因）

研究人员在使用Perturb-map研究不同的基因扰动如何影响肿瘤病变内和周围的免疫细胞募集和维持时发现，Tgfbr2 基因敲除(KO)和Socs1 基因敲除(KO)的病变均在体内富集，显示出免疫组合物的倒置模式。Tgfbr2病变明显排除了免疫细胞，特别是CD4和CD8 T细胞（图3E-3J和3K），而Socs1病变由T细胞高度浸润（图3E-3G，3I和3K）。Socs1肿瘤的EpCAM（一种标记上皮细胞并由KP细胞表达的粘附分子）表达水平也较低。这表明分化的改变，与中度至低度分化的Socs1 KO肿瘤的组织病理学一致。

研究人员在评估每个肿瘤病变内免疫细胞的空间分布时，研究人员发现，在Irf1病变中，CD11c细胞在整个肿瘤中富集，并且在Socs1病变中，CD4和CD8细胞的富集穿透肿瘤核心（图3F，3I和3K）。与F8肿瘤相比，用对照抗体治疗的小鼠具有更多数量的Socs1 KO肿瘤，但是当我们用抗PD-L1治疗小鼠时，比例翻转，并且Socs1肿瘤耗竭更多 ，表明Socs1 KO使肿瘤对PD-L1阻断更敏感。

研究人员在使用Perturb-map来研究邻近的肿瘤是否影响了彼此的免疫浸润时发现，具有相邻Socs1 KO肿瘤的肿瘤病变不倾向于显示更高的T细胞浸润，而Tgfbr2 KO肿瘤相邻的肿瘤病变也没有更多的T细胞被排除在外（图3G）。即使当Tgfbr2 KO 病变直接与高度浸润的 Socs1 KO 病变相邻时，Tgfbr2 KO 病变仍能保持免疫力（图3K）。这表明，至少在SOCS1和TGFβ途径改变的情况下，在彼此密切接触的肺肿瘤病变中，免疫细胞的组成和空间排列是非常局部的。虽然这可能取决于特定的分子改变，因为一些基因表达变化可能具有更远端的影响，但Perturb-map可以提供一种按比例计算的方法，以评估特定的遗传改变如何影响局部，近端和远端TME状态。

（图3：基因KO肿瘤病变中免疫组成的perturb-map分析）

随后，研究人员将perturb-map与空间转录组学耦合，分析表明Tgfbr2丢失对KP肺癌细胞的结果是肿瘤中的TGFβ表达增加以及TME中的TGFβ途径激活。这表明在Tgfbr2 KO病变中观察到的基质重塑和免疫排斥的潜在机制是癌症相关成纤维细胞的TGFβ激活。这也证明了空间转录组学与perturb-map整合，可以以空间分辨的方式对不同的基因扰动进行无偏倚的分子分析。

2021年12月15，Matthew B Dong 等人在Trends Cancer上发表了题为“Tumor immunology CRISPR screening: present, past, and future” 的评论文章。该文章回顾了肿瘤免疫学背景下围绕CRISPR筛选的当前文献，提供了进行免疫特异性CRISPR筛选所需的基本成分，并为未来的研究提供了途径。

简评  

Perturb-map作为一种新型的功能基因组学方法，它拓宽了可以在功能基因组学筛选中研究的基因类型和基因功能，其优点在于能够在组织内以单细胞分辨率进行功能基因组学研究，并且保留完整的空间结构。此外，它还可以用于研究免疫细胞募集和维持，和特定基因扰动后肿瘤彼此的免疫浸润。

                              ——Zhiyuan Cheng

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867422001957?ref=cra_js_challenge&fr=RR-1