2、与肿瘤内和瘤周CD8+淋巴细胞数量较高相一致，EBV+和MMRdGCs均与PD-L1阳性状态相关(CPS≥1；分别为81.8%和73.5%，P<0.001)。对于MMRpGCs，仅27.8%的病例为PD-L1阳性(图8A)。此外，与所有亚型的PD-L1阴性肿瘤相比，PD-L1阳性肿瘤的CD8+TILs数量增加，且与肿瘤细胞越接近(CD8^all、CD8^int和所有其他距离内的P<0.001；图8C)。当PD-L1阳性表达的cut-off值提高至CPS≥5时，EBV+和MMRdGCs仍然与PD-L1状态阳性相关(分别为P<0.001)，但MMRpGCs中的PD-L1阳性比例下降至12.3%，MMRdGCs下降至40.8%，EBV+GCs下降至63.6%(图8B)。

图8 PD-L1 表达与EBV、MMR状态、以及肿瘤浸润淋巴细胞的相关性. ***P≤0.001

3、根据PD-L1的状态和肿瘤浸润淋巴细胞的数量，实体瘤的肿瘤微环境可分为四个不同的免疫亚型，这些亚型反映了其免疫状态。类似的，本研究根据EBV+、MMRd和EBV-MMRpGCs的PD-L1状态和CD8^int类别，将所有病例也分为四个亚型：I型(适应性免疫抵抗；PD-L1+/CD8^int高)，II型(免疫忽视；PD-L1-/CD8^int低)，III型(固有诱导；PD-L1+/CD8^int低)和IV型(免疫耐受；PD-L1-/CD8^int高)(图9)。EBV+和MMRdGCs主要表现为I型肿瘤微环境，而EBV- MMRpGCs最常表现为II型肿瘤微环境。

图9 根据PD-L1表达状态和肿瘤内CD8+淋巴细胞数量判定的肿瘤免疫微环境类型在EBV+、MMRd和EBV-MMRpGCs 中的分布

【结论】通过对PD-L1和CD8的免疫组化检测，并辅以数字图像分析，本研究发现了一种PD-L1表达阴性，同时EBV阴性和pMMR的肿瘤亚型，该亚型中的肿瘤细胞含大量的CD8+淋巴细胞浸润。该亚型可能对免疫治疗产生良好应答。

目前，预测胃癌免疫治疗疗效的标志物有dMMR/MSI-H，EBV阳性等。对于EBV-MMRp这一人群，如何进一步筛选出免疫治疗的优势人群？本文搜集了409例胃癌患者原灶切除标本，通过原位杂交技术检测EBV的扩增状况，免疫组化分析MSH1、PMS2、MSH2、MSH6、PD-L1和CD8的表达；同时采用HALO™图像分析平台测量CD8+TILs与癌细胞的接近程度，并将肿瘤细胞上皮内或距肿瘤细胞上皮≤1um的邻近CD8+T淋巴细胞定义为CD8^int。研究者首先证实了EBV+患者及MMRd患者与CD8^int数量高度相关，同时也与PD-L1高表达密切相关。最后，研究者根据PD-L1表达状态和CD8^int数量将患者的免疫微环境分为四个亚型：I型(适应性免疫抵抗；PD-L1+/CD8^int高)，II型(免疫忽视；PD-L1-/CD8^int低)，III型(固有诱导；PD-L1+/CD8^int低)和IV型(免疫耐受；PD-L1-/CD8^int高)。其中，EBV+和MMRd患者主要表现为I型肿瘤微环境（分别占82%和69%）。EBV-MMRp 患者最常表现为II型肿瘤微环境（43%），此亚型的免疫治疗疗效最差。但是，在EBV-MMRp 患者中，IV型免疫微环境所占比例也高达29%；这一亚型的患者虽然肿瘤细胞PD-L1表达阴性，但是肿瘤细胞中含大量的CD8+淋巴细胞浸润，提示人体对肿瘤是做出了免疫应答的，因此该亚型应是一类对免疫治疗潜在敏感的免疫表型。