随着对结直肠癌病机制的深入研究和精准医学的发展，发现了越来越多的与结直肠癌发病和治疗相关的基因，生物标志物的检测目前已成为晚期结直肠癌临床研发中的重要内容，同时直接影响了晚期结直肠癌的规范治疗。

（一）常用生物标志物

目前与结直肠癌发病相关性明确的生物标志物包括RAS、MSI/MMR和BRAF等，这些靶点相关的药物研发发展迅速，获批药物也主要集中在上述靶点。

1．RAS基因点突变：

KRAS和NRAS是由RAS家族成员基因编码的两种GTP酶蛋白，参与表皮生长因子受体（EGFR）的信号转导，调控细胞生长、分化、增殖和存活。40%~50%的结直肠癌患者存在KRAS点突变^[3]；KRAS自身内在的GTPase活性和GDP-GTP交换活性在不同KRAS突变中是不尽相同的。例如，第12、13和61位突变一般会使KRAS内在的GTPase活性减弱^[4]。我国KRAS p.G12C在结直肠癌的突变率为2.5%^[5]，并且KRAS p G12C受试者的预后较差^[6]。3.8%的结直肠癌存在NRAS基因点突变^[7]。RAS突变影响结直肠癌患者针对EGFR靶向治疗的疗效。

2．BRAF基因点突变：

BRAF基因作为RAF原癌基因家族的成员，位于RAS基因下游，是RAS-RAF-MEK激酶通路上的关键成员。在亚洲结直肠癌患者中，BRAF突变率为5.4%~6.7%^[8]。另有研究显示，BRAF基因突变的转移性结直肠癌患者中，90%为BRAF V600E突变^[9]。BRAF突变患者受益于针对BRAF，EGFR及MEK的联合靶向治疗。

3．微卫星不稳定（MSI）状态和错配修复（MMR）蛋白表达：

MSI状态和MMR蛋白表达是包括结直肠癌在内的泛瘤种免疫检查点抑制剂疗效的预测指标^[10]。根据微卫星的不同状况可将患者分为3种，即：高度微卫星不稳定（MSI-H）、低度微卫星不稳定（MSI-L）和微卫星稳定（MSS）。MMR蛋白的IHC检测，需同时检测4个常见MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表达。其中≥1种表达缺失，判定为错配修复基因缺陷（dMMR）；全部阳性，则判定为错配修复基因完整（pMMR）。MSI-H/dMMR 转移性肿瘤患者对于免疫检查点抑制剂疗效较好。

（二）其他生物标志物检测

除上述常用生物标志物外，目前，其他潜在的生物标志物在结直肠癌中的发生率低，临床意义及靶向治疗的反应性尚在评价中，如HER2扩增/过表达、NTRK融合、PIK3CA突变和肿瘤突变负荷（TMB）。

1．HER2：

HER2是EGFR基因家族成员，其作为结直肠癌的原癌基因之一，可通过激活RAS-RAF-MEK和PI3K-AKT-mTOR通路，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤新生血管形成。结直肠癌中HER2扩增/过表达的总体发生率约为5%^[11]。

2．NTRK基因融合：

NTRK基因融合在结直肠癌中比较罕见，发生率约为0.35%^[12]。NTRK抑制剂仅对携带NTRK融合的患者有效，而对突变患者无效。

3．PIK3CA突变：

在中国人群中PIK3CA突变率仅为3.5%^[13]，与RAS信号通路共同构成EGFR下游两条平行通路。与RAS和BRAF基因突变的排他性不同，PIK3CA突变可与RAS突变共同存在^[14]。PIK3CA突变与抗EGFR单抗疗效的相关性目前尚不能完全确定。

4．TMB：

TMB是肿瘤组织DNA中基因组体细胞突变数的指数，它是测量肿瘤细胞内编码蛋白的平均每百万碱基（1Mb）范围内的非同义碱基突变数量，包括基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失等各种形式的突变。高TMB患者对于免疫检查点抑制剂疗效可能更好，同时需考虑肿瘤发生部位，以及CD8+细胞与新抗原的表达等情况^[15]。

在晚期CRC的新药研发中，根据结直肠癌发生发展的病理生理及分子机制开展探索性研究，通过更多的临床前和临床研究探索相关的生物标志物，寻找可能的药物靶点及联用机制，从而促进结直肠癌的新药研发。

早期临床试验在新药临床研发过程中起着十分重要的作用，通过对晚期结直肠癌肿瘤生物学特征和病理生理过程的深入研究，结合药物的作用机制以及非临床研究结果，借鉴同类靶点药物的临床研发经验，选定适合的人群和最能体现新药作用特点的有效性研究终点进行探索性试验。一方面为后续的关键试验的研究设计和终点选择提供重要依据，另一方面也能通过早期试验数据的有效性和安全性结果，决定加速临床试验或及时终止研发。

（一）人群选择

晚期结直肠癌近年来的临床研究进展较快，一二线治疗除了以化疗作为标准治疗，在化疗的基础上还有多个抗血管生成分子靶向药物及抗EGFR靶向药物联合化疗获批用于晚期CRC的治疗。同时,在三线治疗中也有多个药物获批。

因而，从受试者保护的角度考虑，单药的早期探索性试验建议在标准治疗失败或者不能耐受的患者中开展，即受试者既往接受过充分的治疗。同时，入组人群应选择经病理组织学/细胞学检查确诊的晚期结直肠癌患者，应对患者的基线状态、既往治疗情况、生物标志物状态等进行详细记录。在获得相对充分的、较现有治疗疗效更好的有效性证据之后，可考虑在同一线受试者中进入关键研究，或者进一步在上一线或更早期的患者中开展单药或联合的探索性研究。

探索性研究需要合适的样本量为后期关键研究提供依据，通常在开展关键研究前，非生物标志物富集的人群中期望获得50-60例的探索性的数据，而在生物标志物富集人群中获得20-30例的探索性数据。对于特别罕见的生物标志物富集人群，药物治疗靶点明确，样本量可基于疾病特征和药物机制进行估算。

（二）临床研究设计

对于早期探索性研究，通常研究目的是初步探索药物的有效剂量范围、安全性和初步的有效性，进行合理的起始剂量及递增剂量的选择，可以采用新的研究设计，推荐应用与药效相关的一个或多个生物标志物进行剂量-暴露量-效应（如药效动力学，PD）分析，合理确定II期试验推荐剂量（RP2D）。必要时也可以应用模型引导药物研发（MIDD），进行合理的剂量选择、选择合理的风险应对措施、预测安全性风险或识别重要的生物标志物。

对于完成了早期探索性研究之后开展的概念验证性研究，通常研究目的是对药物的有效性进行进一步的探索，从而为确证性研究提供依据。研究设计可以采取单臂研究，也可以是与具有充分循证医学证据的标准治疗或安慰剂联合最佳支持治疗或研究者选择治疗对比的随机对照研究，如晚期结直肠癌三线治疗中，在中国获批的包括呋喹替尼、瑞戈非尼、曲氟尿苷替匹嘧啶片，三者均可作为对照组，但通常基于研究的均一性，可能只选择其中一种治疗。

对于探索生物标志物富集人群的创新药，建议在探索性试验时进行疗效预测生物标志物的分析，纳入生物标志物阳性以及阴性患者进行概念验证。如概念验证试验提示出某生物标志物具有较强的疗效预测潜力，建议在早期探索性试验中考虑伴随诊断试剂盒的同步研发。

在晚期CRC的探索性试验中可采用创新的试验设计，如采用适应性设计优化爬坡设计和剂量选择，可以采用贝叶斯的方法进行无缝试验设计，也可考虑采用伞式设计或平台设计在同一试验中纳入不同的研究队列，结合生物标志物研究，更高效率地探索药物疗效，并可早期发现有效药物并尽早终止无效或治疗效果不理想的药物。

（三）研究终点

探索性研究的目的通常为探索剂量、探索生物标志物或者目标人群，为确证性试验积累有效性证据，并且通过探索性试验的获益特征，为确证性试验的终点选择和统计假设提供依据。有效性终点通常推荐采用ORR、TTP和PFS等替代终点。

通常抗肿瘤药物在探索性试验中更加关注ORR、DOR和PFS等替代研究终点的获益情况，单臂研究中通常关注ORR情况，以期了解药物直接抗肿瘤活性的情况。同时对于具有更好生存获益的药物，或者ORR虽然较低但是PFS和OS有明确获益的药物，可以结合一定时间的PFS率、OS率，综合分析药物的疗效情况。对于一些联合用药的析因设计试验等对照设计的探索性试验，由于具有对照组，均建议关注PFS等生存终点获益，除非ORR的提高具有十分显著的区分度。

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