肝内胆管癌(iCCA)病率在过去几十年间以十倍的速度增长，因其发现时多处于晚期，因此治疗非常受限。因此，迫切需要对iCCA的发病机制进行更深入的了解，以帮助确定合适的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展，多维组学策略包括蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析结合基因组分析，阐明了新的疾病亚型和信号通路，并发现了多种癌症治疗的潜在靶点。这种多组学策略可能有助于揭示新的机制和确定新的靶点，为iCCA患者提供额外的治疗选择。因此在本文中作者对262名中国iCCA患者进行了基因组、转录组、蛋白质组、磷蛋白质组和微生物组综合分析，以探索iCCA的复杂机制并为临床中的精准治疗提供了指导与帮助。
一、摘要
本文作者使用来自 262 名患者的配对的肿瘤和相邻肝组织对iCCA 进行了蛋白质组学特征分析。综合蛋白质组学分析优先考虑遗传畸变并揭示 iCCA 发病机制的特征。黄曲霉毒素特征与肿瘤起始、增殖和免疫抑制有关。突变相关信号谱显示 TP53 和 KRAS 共突变可能通过整合素-FAK-SRC 途径促成 iCCA 转移。FGFR2 融合激活了 Rho GTPase 途径，可能是新抗原的潜在来源。蛋白质组学分析确定了四个具有亚组特异性生物标志物的患者亚组 (S1-S4)。这些蛋白质组亚组在预后、遗传改变、微环境失调、肿瘤微生物群组成和潜在治疗方面具有不同的特征。SLC16A3 和 HKDC1 被进一步鉴定为与 iCCA 细胞代谢重编程相关的潜在预后生物标志物。该研究为研究人员和临床医生进一步确定 iCCA 的分子发病机制和治疗机会提供了宝贵的资源。
二、流程图
三、结果简述
1. 中国iCCA患者的蛋白质基因组图谱
作者首先对253例iCCA患者(FU-iCCA)的遗传特征和相关的临床病理特征进行分析和描述（图A），识别了16个显著改变的驱动基因，包括TP53，KRAS，FGFR2等。进一步分析表明，KRAS突变与IDH1/2、BAP1和FGFR2突变相互排斥。FGFR2突变与TP53、KRAS和IDH1/2突变相互排斥，这种缺乏重叠表明这些改变可能是的胆管癌发生的独立驱动事件。此外，在MSK，ICGC，FU-iCCA等队列中观察到了不同的突变特征和突变分布，图B展示了3个队列中8个高频突变的突变频率差异。此外作者发现黄曲霉毒素特征(Signature 24;图C)在7.1%的FU-iCCA队列和9.7%的Zou等人的队列中观察到，这两个队列均为中国队列，但在三个西方队列中不存在。在马兜铃酸(AA)特征中也观察到类似的趋势(Signature 22;图C). 而具有黄曲霉毒素与AA特征的患者的TMB和新抗原负荷明显增高(图D)。通过比较所有具有或不具有黄曲霉毒素特征的肿瘤的多组学数据，发现具有黄曲霉毒素特征的肿瘤表现为DNA修复和细胞周期通路上调，而凋亡、感染炎症和免疫通路下调(图E)。进一步分析发现，TP53突变，尤其是R249S突变与黄曲霉毒素特征显著相关(图F-G)。与之前的报道一致，黄曲霉毒素可诱导R249S改变，提示黄曲霉毒素在iCCA致癌性中发挥作用。
2. 体细胞拷贝数变异之多组学分析
与之前的研究一致，在染色体6p21.33(43.5%)和1q21.3(33.2%)中获得最多，在染色体5q23.3(20.2%)和1p36.11(20.2%)中丢失最多。还观察到STK19、HIST1H1E， MCL1和MDM4等已知致癌基因的扩增，以及ARID1A、MAP2K4和MLH1等抑癌基因的缺失。这些拷贝数改变(CNAs)对mrna、蛋白质和磷蛋白丰度有顺式和反式影响(图A)，MRNA、蛋白质和磷酸化蛋白分别观察到总计3981、1081和408个显著的顺式相关性，在所有3个组学中只有194个显著的顺式效应重叠(图B)。总共有963个蛋白质同时显示了CNA-mRNA和cna -蛋白顺式效应，这些效应主要富集在代谢、生物合成和蛋白质加工途径中(图C)。此外，在前10个反式事件的癌症基因普查中显示，MDM4扩增与免疫治疗的进展有关(图D)。在染色体1p和14q中，表现出最多的CNA蛋白和CNA-mRNA反式事件的基因(图A)。值得注意的是，14q缺失与整体蛋白质组和转录组丰度存在差异相关性(图E)，表明这些区域可能存在蛋白质水平调控。对于蛋白质丰度随14q损失增加的585个基因，富集分析发现其主要富集于剪接体、错配修复、DNA复制、细胞周期和代谢的途径(图F)。此外，14q损失对蛋白酶体基因和细胞周期调控因子的蛋白表达分别有顺式和反式影响(显著负相关)，而对mRNA表达没有影响(图G)。总之，14q相关的整体顺式和反式缺失可能为iCCA的肿瘤发生提供了机制基础(图H)。
3. 体细胞驱动基因突变的蛋白质基因组关联分析
接着作者分析了体细胞驱动基因突变对蛋白质组和磷酸化蛋白丰度的影响，重点分析4个突变最显著的驱动基因(TP53、KRAS、IDH1/2和BAP1)。其中，TP53和KRAS突变与较差的生存期显著相关，而BAP1或IDH1/2突变与FU-iCCA队列中的患者生存期无关。TP53突变与细胞周期、药物代谢、吞噬小体和碳代谢通路上调，以及ECM灶性黏附、PI3K-AKT和Hippo-YAP信号通路下调相关(图A)。KRAS突变与炎症-感染和ECM灶性黏附通路中的蛋白增加有关，与细胞周期通路中的蛋白减少有关(图B)。有趣的是，作者发现队列中的10/215名iCCA患者存在TP53和KRAS共突变，且生存率明显低于TP53或KRAS单突变患者(图C)。细胞粘附相关分子ITGA6、ITGB4、ITGB6、CDH3和CLDN18在TP53与KRAS双突变肿瘤中表达量最高(图D-E)。有报道称KRAS和TP53突变可以通过转录因子FOSL1和miR-30e-5p促进ITGA6的表达，TP53与KRAS共突变肿瘤的区域淋巴结转移率最高(40%)，因此，TP53-KRAS共突变可能通过整合素- FAK - SRC途径促进iCCA的转移和进展(图F)。进一步分析发现，在BAP1突变和IDH1/2突变的肿瘤中，ECM和胆汁分泌通路均相互活跃，而吞噬体、炎症和MAPK通路仅在其中一种中相对活跃(图G-H)。最后，Heatmap显示，与TP53、KRAS、BAP1和IDH1/2突变相关的基因在mRNA和蛋白水平上富集(图I)。
4. FGFR2突变和KRAS突变对蛋白质基因组格局的影响
iCCA中FGFR2信号的增强是由突变和染色体易位介导的。研究发现所有FGFR2突变都位于激酶结构域之外(图A)。在11.9%(30/253)的FU-iCCA中发现FGFR2融合主要是与含有二聚域的融合伙伴产生的，以诱导配体独立受体二聚。融合伙伴包括BICC1 (n = 11)、AHCYL1 (n = 2)、ETV6 (n = 2)、INA (n = 2)等，所有这些融合的FGFR2断裂点(p.E767)相同，并保留其激酶结构域(图B)。每一种融合都通过荧光原位杂交进行了验证(图C)，并确认了断点周围相同的mRNA序列。几乎所有FGFR2融合病例的肿瘤细胞均显示分离的探针信号，表明FGFR2融合是iCCA中的早期克隆事件。随后作者探索了有和没有FGFR2和KRAS改变的肿瘤中显著改变的磷酸位点及其相应的蛋白表达，揭示了两者中的磷酸位点异常值(图D)。KRAS突变的肿瘤表现出明显的MAPK通路级联激活，相反，在FGFR2改变的肿瘤中，MAPK通路轻微下调(图E)。此外，FGFR2改变的肿瘤表现出显著的PTPN11酪氨酸磷酸化(Y62)和TLN1酪氨酸磷酸化(Y70)，在蛋白质水平上观察到相似的趋势(图F)。热图显示FGFR2改变的肿瘤中FGFR2和PTPN11蛋白和PTPN11 Y62磷酸化同时上调，GRB2表达和S90磷酸化下调(图G)。值得注意的是，异常残基Y62位于N-SH2和PTP结构域之间的界面，在这里磷酸化被认为可以稳定活性蛋白的构象(图G-H)。
5. 鉴定来自FGFR2:BICC1融合的潜在新表位及其新表位反应性T细胞表型
基因融合可以产生新的肽候选个体化免疫治疗。对于两个最常见的FGFR2::BICC1融合蛋白，利用跨越断点残基的序列构建包含所有可能的8 - 10个氨基酸多肽的序列数据库(图A)。通过四聚体交换实验，一组合成的肽被成功地交换成HLA-A02:01和HLA-A24:02四聚体(图B)。接下来，用多肽32和33刺激供体1和2的PBMC7天，然后用细胞计数法测定飞行时间(CyTOF)和TCR测序。CyTOF数据显示T细胞表型随着肽刺激而进化(图C)。伪时间分析显示，T细胞朝着激活的方向发展，并在此后分叉进入记忆和耗尽分支，代表了成熟晚期的两个谱系(图5D)。受多肽刺激的T细胞培养具有显著的特征，即具有效应表型的CD8+T细胞显著扩增。进一步的TCR-Seq显示，在肽ILTLTTNEI刺激后供体后，TCR库的分布发生了显著的转变。计算T细胞组成和丰度的Morisita-Horn指数(图E)证实了肽32刺激供体2后TCR的重排，并扩大了多个频率相对较低的CDR3s(图F)。尽管供体间存在异质性，但低频率的新表位T细胞反应性为iCCA融合患者克服免疫编辑和耐药性提供了指向。
6. 具有明显生物学和临床特征的蛋白质组亚群
作者通过对1376个最易变的蛋白质进行聚类，确定了4个不同的蛋白质组亚群(S1-S4)(图A)，具有多种临床、基因组、免疫学和微环境特征。S1中CD14、MPO、C5AR1等炎症蛋白表达最为丰富。S2与癌症相关的成纤维细胞和ECM相关的蛋白水平最高，包括FAP、POSTN和FLT1。S3的特征是MAPK和代谢蛋白(如ACAT1、FASN和IDH1)升高。S4保留了最大限度的粘附蛋白和胆道特异性蛋白的表达，如ANXA4、KRT18和EPCAM(图6B)。生存曲线显示，S1-S4生存期逐渐延长。多变量Cox分析证实，蛋白质组学分类是一个重要的预后指标，独立于临床病理特征。重要的是，蛋白质组学亚组还可以对TNM早期患者的生存率进行分层(图C)。每个亚组显示了不同的周期性改变基因图谱(图D)。KRAS突变在S1中显著富集，炎症途径上调。S3以TP53突变为主，并伴有细胞周期和MAPK信号通路的丰富。FGFR2突变、bap1突变和didh1 /2突变在S4中最常见，部分与胆汁分泌升高有关。随后，利用xCELL等方法分析了蛋白质组亚群中免疫检查点、免疫标记和免疫细胞丰度(图E)。四个亚组特异性标志物MPO(中性粒细胞)、POSTN(成纤维细胞)、ALDOB(代谢)和EPCAM(胆道)分别代表炎症(S1)、间充质(S2)、代谢(S3)和分化(S4)(图F)。最后，在FU-iCCA队列(n = 84)和验证队列(n = 144)中，通过多重免疫染色测量的4个标记物的表达可以对患者的生存进行分层分析(图G)。
7.蛋白质组学生物预后相关标志物的鉴定和验证
进行监督分析来识别预后生物标志物，通过严格的筛选过程发现19个预后良好的蛋白和15个预后不良的蛋白(图A)。其中，HKDC1和SLC16A3在FU-iCCA队列中分别与患者生存呈正相关或负相关(图B)，与常规临床病理特征无关。此外，HKDC1和SLC16A3的表达在四个蛋白质组亚组间存在显著差异，S1中SLC16A3表达上调，S4中HKDC1表达上调(图C)。在另一个独立的iCCA队列中(图D, n = 222)，免疫染色检测HKDC1低表达和SLC16A3高表达分别预示较差的临床结果，基于蛋白质组学和潜在的临床应用证实了它们的预后价值。与之前的报道不同，作者的生存和通路关联分析表明，HKDC1可能在iCCA中发挥抑癌作用。事实上，过表达HKDC1会降低HuCCT1细胞的增殖、集落形成、葡萄糖消耗和糖酵解能力，支持其在iCCA细胞中的抗糖酵解/增殖作用(图E-G)。正如预期的那样，过表达SLC16A3的HuCCT1细胞表现出更快的增殖和更高的集落形成(图F-H)，这可能是由于更强的糖酵解能力。
四、总结与亮点
●确定了与iCCA患者生存、治疗和分子特征相关的蛋白质组亚群
●TP53、KRAS、FGFR2、IDH1/2和BAP1表现出多种途径和治疗潜力
●免疫基因组学显示，FGFR2融合产生肽免疫原性
●HKDC1和SLC16A3是具有生物学功能的重要预后指标
