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血管疾病的单细胞测序~

本期文献解读我们分享一篇2021年4月发表在《Cardiovascular Research》上的腹主动脉瘤单细胞测序的文章，一同学习血管疾病单细胞文章的思路和“腹主动脉瘤的细胞异质性”。

01摘要

目的：动脉中含有多种类型的细胞，可介导各种血管疾病。然而，这些血管细胞在腹主动脉瘤(AAA)进展过程中的异质性和细胞反应尚未得到很好的表征。

方法和结果：在假手术或外膜周围弹性蛋白酶诱导AAA后第7天和第14天，对C57BL/6J小鼠的肾下腹主动脉(IAA)进行单细胞RNA测序。对来自 > 4500个主动脉细胞的转录谱进行无偏倚的聚类分析，鉴定出17个簇，表征9个细胞谱系，包括血管平滑肌细胞(VSMCs)、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞（巨噬细胞、T细胞、B细胞和树突状细胞）和两种少见的细胞类型（神经细胞和红细胞）。Seurat聚类分析鉴定出4个平滑肌细胞(SMC)亚群和5个单核/巨噬细胞亚群，具有不同的转录谱。在AAA进展过程中，三个主要的SMC亚群成比例减少，而小亚群增加，伴随SMC收缩标志物的下调和促炎基因的上调。另一种AAA相关细胞反应是免疫细胞增加，尤其是单核细胞/巨噬细胞。弹性蛋白酶暴露诱导主动脉固有巨噬细胞、血源性单核细胞和炎性巨噬细胞显著增多和活化。我们还发现表达抗炎细胞因子的血源性修复性巨噬细胞增加，表明AAA进展过程中炎症消退和血管修复也持续存在。

结论：我们的数据确定了IAA中血管细胞的疾病相关转录标记。此外，我们描述了AAA进展过程中VSMCs和单核/巨噬细胞的异质性和细胞反应，这为探明其功能和对AAA发生和进展的影响提供了见解。

02研究流程图

03方法简介

IAA动物模型：

通过腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和赛拉嗪(5 mg/kg)的混合物麻醉小鼠，暴露、分离IAAs，并用浸有30ul弹性蛋白酶(E1250，批号SLBV9311，MilliporeSigma)或热灭活弹性蛋白酶(假手术组)的无菌棉包裹IAAs，然后取出浸有弹性蛋白酶的棉花，并在闭合手术切口前用盐水清洗腹腔两次。弹性蛋白酶暴露后7、14和28天或热灭活弹性蛋白酶暴露后14天(Sham)收获IAAs。

单细胞样品制备与单细胞测序：

根据美国国立卫生研究院动物安乐死指南，使用二氧化碳麻醉小鼠，然后通过左心室穿刺灌注 10 mL PBS。主动脉细胞的单细胞悬浮液的制备是按照先前描述的酶消化方案进行的。简而言之，将从每组五只小鼠中收集的 IAA 切割并用酶溶液在 37°C 下消化1.5h。细胞悬液通过 70 μm 过滤器过滤并用 PBS 洗涤三次。将细胞重悬于含 10% FBS 的 opti-MEM 中，通过台盼蓝染色证实细胞活力大于 70%。

而后，对重悬的细胞进行 scRNA-seq（10x Genomics）。

数据处理与分析：

使用 10× Genomics Cell Ranger 软件处理原始 scRNA-seq 数据。CellRanger mkfastq 命令用于生成 Fastq 文件。随后，数据被映射到预构建的小鼠参考基因组（mm10，版本 1.2.0）。将来自IAA细胞的样本聚合后，使用R包Seurat v3.0进行细胞过滤、归一化、主成分分析、可变基因发现、聚类分析和UMAP降维。Seurat 函数 Vlnplot、FeaturePlot、DotPlot 和 DoHeatmap 分别用于小提琴图、特征图、点图和热图的绘制。

04结果解读

4.1 “识别细胞聚类簇和细胞谱系”：

单细胞RNA测序揭示17个细胞簇表征肾下腹主动脉中的9个细胞谱系

弹性蛋白酶诱导的 AAA 模型是在 C57BL/6J 小鼠上进行的（图 S1A - F）。在弹性蛋白酶暴露后第 7、14 和 28 天（Elastase7d、Elastase14d 和 Elastase28d），与假手术组相比，弹性蛋白酶处理组的 IAA 大小随时间增加（图S1A和B）。IAA 连续切片的 Verhoff-Van Gieson 染色表明，弹性蛋白降解在 Elastase7d 中略有增加，在 Elastase14d 和 Elastase28d 中显著增加（图 S1C和D）。

此外，与假手术组相比，弹性蛋白酶处理组中白细胞（Cd45 +）和巨噬细胞（Mac2 +）浸润显着增加（图 S1E）。同时，平滑肌细胞 (SMC) 标记物 SM22α 的免疫荧光染色显示弹性蛋白酶暴露后 SMC 损失增多（图 S1F）。

上述结果与动脉瘤形成相关的病理特征相似，包括动脉扩张、动脉壁退化、主动脉壁炎症细胞浸润和内侧 SMC 丢失。

对Sham、Elastase7d 和 Elastase14d 的 IAA 进行了 scRNA-seq。在质量控制过滤后，分别将 Sham、Elastase7d 和 Elastase14d 的 1509、1737 和 1396 细胞的转录谱纳入随后的分析。通过数据整合和无偏倚聚类在IAA细胞中共挑选出17个细胞聚类簇（图1B-D）。

通过各细胞类型的特异性经典标记区分细胞谱系（图 1E)：

最终，在IAA 细胞中鉴定出9个不同的细胞谱系（图 2）。主要细胞类型包括：(i)平滑肌细胞（SMC , Cluster 1、2、3、4），其高度表达 SMC 典型标志物 Myh11、Tagln 和 Acta2；(ii) 成纤维细胞（Cluster 5, 6），其特征是表达胶原蛋白/胶原蛋白结合蛋白、Dcn、Col1a1 和 Col3a1；(iii) 内皮细胞 (ECs, Cluster 7)，以 Cdh5、Pecam1 和 Fabp4 的表达为标志；(iv) 单核细胞和巨噬细胞（Mo/MΦ，Cluster 8、9、10、11 和 12），表现为Cd68、Cdca3 和 C1qb 的高表达；(v) B 细胞（Cluster 13），高度表达 Cd79a、Ly6d 和 Cd79b；(vi) T 细胞 (Cluster 14)，Cd3d、Cd3g 和 Cd28高表达；(vii) 树突状细胞 (DCs, Cluster 15)，高表达标记基因 Cd209a、Ccr7 和 Ifitm1; 此外，还鉴定出（viii）一小群具有标记基因 Prnp 的神经细胞（Neural，Cluster 16），以及（ix）一小群Bpgm 和 Snca 高表达的红细胞（Eryth，Cluster 17）。

4.2 “整体分析细胞群体变化”：

肾下腹主动脉瘤中血管平滑肌细胞减少、免疫细胞增加

在鉴定的细胞类型中，平滑肌细胞（SMC）、成纤维细胞和单核细胞/巨噬细胞聚集成多个亚群：四个 SMC 簇（cluster 1，SMC_1；cluster 2，SMC_2；cluster 3，SMC_3；cluster 4，SMC_4），两个成纤维细胞簇（cluster 5，Fibro_1；cluster 6 , Fibro_2), 和五个 Mo/MΦ 簇 (cluster 8, Mo/MΦ_1; cluster 9, Mo/MΦ_2; cluster 10, Mo/MΦ_3; cluster 11, Mo/MΦ_4; cluster 12, Mo/MΦ_5) (图3A-C)。

这些结果在单细胞水平揭示了 IAA 细胞的主动脉瘤相关细胞反应，包括 SMC 种群的减少和免疫细胞种群的扩增（图 3D)，这与免疫荧光染色确定的 SMC 和免疫细胞的病理变化一致。

在来自假手术组的 IAA 细胞中，SMC 是最大的群体，占所有细胞的 44.9%；成纤维细胞和总免疫细胞比例相近，分别占20.3%和18.1%；在免疫细胞中，Mo/MΦ是最大的群体，占免疫细胞的55.7%（图3D-E )。

在 AAA 进展期间，血管平滑肌细胞经历表型转换或细胞凋亡。与在人类 AAA 中观察到的病理变化一致，相对于假手术组，小鼠IAA中的 SMC 群体显着减少（假手术组-44.9% vs. Elastase7d组-14.3% vs. Elastase14d组-17.8%，图3B-E）。在动脉瘤明显形成之前（Elastase7d组），主动脉总 SMC 与假主动脉相比减少了 68.2%，并且在 AAA 形成后（Elastase7d组）SMC 数量减少（60.5%）持续进展。

研究者还观察到免疫细胞明显增多（假手术-18.1% vs. Elastase7d-68.8% vs. Elastase14d-62.5%）和成纤维细胞减少（假手术-20.3% vs. Elastase7d-13.2% vs. Elastase14d-12.2%，图3D-E) 。在免疫细胞中，Mo/MΦ、T 细胞和 DC 在 AAA 进展期间增多（Mo/MΦ，Sham-10.1% vs. Elastase7d-45.2% vs. Elastase14d-43.1%；T细胞，Sham-3.5% vs. Elastase7d-14.5%, vs. Elastase14d-10.8%; DCs, Sham-1% vs. Elastase7d-7.2%, vs. Elastase14d-6.2%, 图 3E) 。

此外，通过 UMAP 分析进一步确定了三个 T 细胞亚群（图 S4A），T_1 是最大的亚群，占 T 细胞总数的 50% 以上，并且高度表达 Ly6c2、Cd8a 和 Cd8b1（图 S4B - E）；T_2 表达 Gzma，编码细胞毒性 T 细胞和NK细胞特异性丝氨酸蛋白酶，颗粒酶 A（图 S4C - E）；T_3 表达 Cd4 和 Il2ra，编码 CD25，标记调节性 T 细胞（图 S4D和E)。在 AAA 进展期间，T_1 和 T_3 的比例在第 7 天下降并在第 14 天恢复（图 S4B）。相反，T_2 的比例在第 7 天增加并在第 14 天恢复（图 S4B）。

4.3 “分析重要细胞的异质性”：

4.3.1 血管平滑肌细胞（SMC）表型和功能异质性

如前所述，在假手术和动脉瘤 IAA 中发现了四个不同的 SMC 簇（图4A和图S5A）。

SMC_1、SMC_2 和 SMC_3 占假手术组 SMC 总数的 98% 以上，而 SMC_4占 SMC 总数的不到 2%（图4E）。值得注意的是，在 AAA 形成后总 SMC 显着减少，SMC_1、SMC_2 和 SMC_3 也按比例减少，并在 AAA 发展过程中表现出相似的比率；而SMC_4 从假手术组和 Elastase7d 组中的总SMC< 2% 增加到 Elastase14d组中的10%。

尽管所有四个簇都被鉴定为SMC，但它们仍然具有不同的表达谱。使用Bonferroni 校正的 Wilcoxon 秩和检验发现了 34 个显著差异表达的标记基因（P <0.001，avg_logFC > 1）。

SMC_1 和 SMC_2 中SMC 特异性收缩标志物（Myh11、Acta2、Tagln 和 Myl9）均高表达且胶原蛋白和细胞因子基因（Col1a1、Col1a2、Col3a1、Ccl4、Cxcl1、Bmp2 和 Tgfb2）、信号受体基因（Pdgfrb）以及干细胞标记基因 Ly6a（编码 Sca1）均低表达（图2，图4E，图 S5E）。此外，SMC_1 和 SMC_2 在弹性蛋白酶处理后显示出相似的基因表达模式，包括 Myh11 和 Tagln 的下调，以及 Ctss、Adamts1、Cxcl2 和 Ccl2 的显着上调（图4E-F，图 S5D-E）。

与之前的报道一致，静息的收缩型 VSMC 在 AAA 进展期间可以经历表型转换为促炎表型。SMC_2 的标记基因将其与其他三个 SMC 簇区分开来，包括 Fos、Jun、Klf2 和 Atf3，它们对于调节细胞生长和增殖都很重要。这些生长调节基因在 SMC_2 中过度表达，弹性蛋白酶暴露进一步上调了它们的表达（图4E-F，图 S5D-E），提示 SMC_2 的生长功能和激活状态维持。值得注意的是，DUSP1（编码有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1，可通过灭活MAPK抑制血管平滑肌细胞增殖），也在SMC_2中高表达（图4C-D，图 S5C），这可能有助于维持 SMC_2 的表型稳态。在这里，我们将SMC_1称为静止、收缩型SMCs，将SMC_2称为增殖、收缩型SMCs。

在SMC_3的标记基因中，编码抗氧化金属硫蛋白1和2的Mt1和Mt2表现出选择性表达（图2，表 S_II）。另一方面，SMC_3 中Hk2（编码糖酵解酶己糖激酶 2）显著高表达（图 4E，图 S5D）。Hk2 表达升高可能驱动能量从氧化磷酸化转变为糖酵解以响应能量衰竭。因此，与其他三个 SMC 簇相比，SMC_3 可能具有替代的生物能量学特征。此外，Gata6 是 GATA 家族中唯一在 VSMC 中表达并调节其生长和适应的成员，其也在 SMC_3 中特异性高表达（图 4E，图 S5D）。基于SMC_3 中收缩标记的最低表达和改变的代谢特征，该簇可被称为去分化的 SMC。

对于 SMC_4，多个标记基因选择性高表达，包括 Sparcl1、Igfbp5、Sncg 和 Thbs1。在差异表达基因中，Thbs1也在巨噬细胞中高表达。此外，Notch3 是 VSMC 动脉分化和成熟的细胞自主调节因子，也在 SMC_4 中特异性高表达（图 4E，图 S5D）。弹性蛋白酶暴露后SMC_4 中促炎因子显著高表达，包括 Cd68、Cxcl1、Cxcl2 和 Il1r1（图4 E-F，图 S5D-E）。值得注意的是，免疫荧光染色显示少量内侧 SMC 表达巨噬细胞标记物 (Mac2，图 S1F）。此外，假手术组SMC_4中SMC特异性收缩标志物高表达，然后在弹性蛋白酶暴露后第7天下降并在第14天恢复（图 4E，图 S5D）。因此，SMC_4表现为促炎表型，并在 AAA 发育后期增加，因此被称为炎症样 SMC。

图4C-D

图4E-F

图 S5C-E

4.3.2 巨噬细胞的异质性——主动脉驻留巨噬细胞和血源性巨噬细胞均参与 AAA 进展

如前所述，在IAA 细胞中鉴定了五个巨噬细胞簇（Mo/MΦ_1、Mo/MΦ_2、Mo/MΦ_3、Mo/MΦ_4 和 Mo/MΦ_5）。在假手术组中，62.5%的Mo/MΦ细胞对应于Mo/MΦ_1，其他四个簇仅占37.5%（分别为11.8%、11.8%、13.2%、0.7%）（图 5E）。与假手术组相比，IAA中巨噬细胞总群显著增多。在鉴定的巨噬细胞簇中，弹性蛋白酶处理的 IAA 中 Mo/MΦ_2、Mo/MΦ_3、Mo/MΦ_4 和 Mo/MΦ_5 的比例增加，Mo/MΦ_1 的比例降低（图 5B，图 S6B），提示Mo/MΦ_1 的独特起源或功能。

尽管典型的巨噬细胞标记，包括 Cd14、Cd68、Adgre1、H2-Aa（编码 MHC-II）和 Fcgr1（编码 CD11b）在五个 Mo/MΦ 簇中均表达，但仍有多个基因在各亚群之间差异表达。

基于 Cx3cr1 +和 Flt3 + 特征，Mo/MΦ_1 和 Mo/MΦ_5 被鉴定为主动脉驻留巨噬细胞 (AR-MΦ)，可能分别源自 Cx3cr1 +祖细胞和 Flt3 祖细胞（图 5E)。由于组织驻留巨噬细胞主要通过局部增殖维持，几乎没有来自骨髓的输入，因此在弹性蛋白酶诱导骨髓来源的 Mo/MΦ 分数增加后，Mo/MΦ_1 分数随之减少（图 5E）。假手术组中最小的亚群 Mo/MΦ_5在弹性蛋白酶暴露后随时间增加（图5B，图 S6B），提示 Mo/MΦ_5 具有高增殖活性。

在基础和弹性蛋白酶处理条件下，Mo/MΦ_1 均显示出高表达炎症巨噬细胞标志物 Mrc1、Maf4 和 Pf4，它们参与吞噬作用，以及 C1 补体基因 C1qa、C1qb 和 C1qc，以及促炎细胞因子Ccl2、Ccl4、Ccl7、Ccl8、Ccl9、Ccl12、Cxcl2、Cxcl16，所有这些都参与了新炎症细胞的募集（图5C-E，图6A，图S6D-E）。此外，Mo/MΦ_1 还高表达蛋白水解基因，包括 Mmp9 和组织蛋白酶（Ctsc、Ctsd 和 Ctss）（图 6B，图 S6F），它们在血管重塑和主动脉瘤形成中起着至关重要的作用。

Mo/MΦ_5 表现出增殖特征，涉及细胞增殖的基因，如拓扑异构酶 II α (Top2a) 和 Stmn1，以及与微管活性相关的基因，如 Tubb5 和 Tuba1b 33（图5C-D）。有趣的是，Mo/MΦ_5 在弹性蛋白酶暴露后表现出炎症基因（如 Ccl2、Ccl3、Ccl7、Ccl12、Cxcl2 和 Il1b ）和抗炎基因 IL10 的共表达（图 6A )，这表明主动脉驻留巨噬细胞 Mo/MΦ_5 可能有助于减轻 AAA 进展过程中的炎症。

血液来源的单核细胞（Mo）和单核细胞来源的巨噬细胞也参与形成血管组织中的 Mo/MΦ池，可通过 MΦ 标记物进行区分，包括 Adgre1 (F4/80)、Itgam (Cd11b) 和 H2-Aa ( MHC-II)。

Mo/MΦ_2 被鉴定为血源性单核细胞，而 Mo/MΦ_3 和 Mo/MΦ_4 被鉴定为 Mo-衍生的巨噬细胞 (图5C-E，图S6D）。此外，Mo/MΦ_2 也表现补体基因（C1qa、C1qb 和 C1qc）和促炎细胞因子（Ccl2、Ccl3、Ccl9、Ccl12、Cxcl2、Cxcl10 和 Il1b）的高表达，这些基因参与炎症细胞的募集（图 5E、6A，图 S6D-E）。

最近的证据表明 M1 和 M2 激活状态的传统标记并不相互排斥。因此，我们检查了 M1 标记物（例如 Ccl2、Ccl3、Cxcl10 和 Il1b）和 M2 标记物（例如 Arg1、Egr2、Il1r2 和 Il10）的表达。相比之下，Mo/MΦ_3 表现出 Arg1、Egr2 和 Il1r2 的高表达，而Mo/MΦ_4 高表达炎症基因，如 Ccl2、Ccl3、Ccl7、Ccl8、Ccl12、Cxcl10、Cxcl16 和 Il1b，以及蛋白水解基因，如如 Mmp9、Ctsc、Ctsd 和 Ctss (图 5C、E、6A，图 S6E）。因此，这两个亚群分别被定义为抗炎性巨噬细胞（Mo/MΦ_3）和炎性巨噬细胞（Mo/MΦ_4）。Mo/MΦ_3 还包含表达促炎基因的细胞，如 Ccl9、Cxcl2、Cxcl3 和 Il1b，Mo/MΦ_4 也包含表达 M2 标志物的细胞（图 5C、6A，图 S6E）。这表明 M1 和 M2 标记的表达并不相互排斥，并且一组传统标记对表征体内巨噬细胞的编程状态不够敏感，与近年关于 M1 和 M2 状态的新概念一致。此外，弹性蛋白酶诱导血管损伤后Mo/MΦ_3的比例增加（图5B，图S6B )，表明在 AAA 进展期间，修复性巨噬细胞介导的炎症消退和血管修复作用也同时存在。